Se construyó entre los años 1480 y 1560 bajo el patronazgo de la familia Mendoza, condes del Real de Manzanares, como panteón familiar y en el sitio de la antigua Iglesia de Santa María.

Tiene tres portadas realizadas de piedra caliza. La Portada Principal, con el grupo escultórico de La Piedad en el frontón, se remata con un florón que sirve de base a la Virgen con el Niño, bajo una moldura decorada con once colmenas de corcho, alusivas al escudo de Colmenar. A la izquierda, el escudo del tercer Duque del Infantado, D. Diego Hurtado de Mendoza y, a la derecha, el de su esposa, Dña. María Alonso de Pimentel, hija de los Condes de Benavente. Flanquean la portada las esculturas de San Pedro y San Pablo.

La Torre, a los pies de la basílica, tiene más de 50 metros de altura. Está dividida en tres cuerpos, rematada con un chapitel octogonal. Las gárgolas tienen forma de dragón y de león. La escalera de acceso al coro tiene una balaustrada de granito de estilo renacentista. En el hueco de subida está la pila bautismal, una de las piezas más antiguas del templo junto con el relieve del retablo de la Encarnación. Además de éste y del retablo Mayor, la basílica tiene otros dedicados a la Inmaculada concepción, a la Virgen del Rosario, a Nuestra Señora del Carmen, a San Juan Nepomuceno y a Santa Ana.

El Retablo Mayor es un magnífico conjunto de arquitectura, escultura y pintura, considerado, por su magnitud y calidad, una de las obras más notables del arte castellano de su época, incluyéndose dentro de la escuela toledana, tanto por su tipología como por los artistas que intervienen en él. Se realizó entre los años 1.560 a 1.584 y se enmarca en el Renacimiento Plateresco. Trabajaron en el retablo Alonso Sánchez Coello y Francisco Giralte entre otros.

El Sagrario o Tabernáculo ocupa el banco y el primer cuerpo del retablo. Dispuesto como un armario eucarístico, el exterior de las puertas se decora con relieves.

El retablo se remata con un Calvario en el ático, donde Cristo crucificado aparece flanqueado por San Sebastián y San Juan Bautista. En el frontón triangular que corona la escena, emerge la figura de Dios Padre con el orbe en la mano izquierda y bendiciendo con la derecha.